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                                                    菌种保藏方法

                                                    发布日期:2017-01-07

                                                       本文来自百度经验,内容介绍了目前所有的微生物保存方法。包括传代保存法、液体石蜡覆盖保存法、载体保存法、悬液保存法、寄主保存法、冷冻保存法、冷冻干燥保存法、甘油管保藏法等。我们觉得内容很全面了,分享给各位老师。

                                                    1、传代保存法:有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时,会很快死亡,因此在这种情况下,只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、

                                                    培养后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生产菌种的保存。传代保存时,培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的

                                                    浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙?! ∫话愕?,大

                                                    多数菌种的保藏温度以5℃为好,像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存,而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。

                                                    传代培养保存法虽然简便,但其缺点也很明显,如:①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时,菌株的病原性、形成生理活性物

                                                    质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种,工作量大;⑤杂菌的污染机会较多?! ?/font>

                                                    2、液体石蜡覆盖保存法:该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥,并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方

                                                    法简便的优点,同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存,而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存?! ?/font>

                                                    3、载体保存法:即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种,如 ?、偻寥辣4娣ǎ褐饕糜谀苄纬涉咦踊蜴吣业奈⑸锞值谋2?。方法是在灭菌的土壤中加入菌液,立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥,然后冷藏或在

                                                    室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜,土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是:取适量土壤(5克)置于塞有棉塞的试管中,加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜),然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种,培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止,移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封,冷藏或室温保存?! 、谏巴帘4娣ǎ喝∏褰嗟纳?,筛去掉大砂粒,并用磁铁吸去砂中铁屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次,干燥后,置于试管或安瓶管中保持2~3cm深,再经干热灭菌后,加入1ml菌种培养液,经充分混匀后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌,再进行菌种保藏?! 、酃杞罕4娣ǎ阂?~16目的无色硅胶代替砂子,干热灭菌后,加入菌液。加菌液时,由于硅胶的吸附热常使温度升高,因而需设法加以冷却?!、艽胖楸4娣ǎ航航胨厣沾胖?或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4),上铺玻璃

                                                    棉,再放上10~20粒磁珠,经干热灭菌后,接入菌悬液,最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效,特别适用于根瘤菌,可保存长达两年半时间?! 、蒴锲け4娣ǎ涸隰锲つ诩尤?0%的水,经灭菌后接种培养,最后干燥保藏?! 、拗狡?滤纸)保存法:将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中,常压或减压干燥后,置于装有干燥剂的容器内进行保存?! ?/font>

                                                    4、悬液保存法:即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有, ?、僬袅笏4娣ǎ菏视糜诿咕?、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发?! 、谔且罕4娣ǎ菏视糜诮湍妇?,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存?! ?/font>

                                                    5、寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法?! ?/font>

                                                    6、冷冻保存法:适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤,而对其它大多数微生物而言,无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结,都会对菌体造成损伤,因此当采用这种保藏方法时,应注意以下几点, ?、僖≡袷视诶涠掣稍锏木湎赴? ?、谝≡袷室说呐嘌?,因为某些微生物对冷冻的抵抗力,常随培养基成分的变化而显示出巨大差异; ?、垡≡窈鲜实木号ǘ?,通常菌液浓度越高,生存率越高,保存期也越长; ?、茏詈迷诰耗诓惶砑拥缃庵?如食盐等); ?、菘稍诰耗谔砑痈视偷缺;ぜ?,以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样,也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好?;ばЧ娜芗?,但对有些微生物而言,不加?;ぜ潦备行??! 、拊蛏嫌】旖欣涠炒?,但当加入?;ぜ潦?,可静置一段时间后再进行处理?! 、呔投锵赴?,应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温,此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言,则不必如此,如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温,而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻; ?、嗳艚谐て诒4?,则贮藏温度越低越好; ?、崛∮美涠潮4娴木质?,应采取速融措施,即在35~40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说,则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后,应尽量避免再次冷冻,否则菌体的存活率将显著下降?! 〕S玫睦涠潮4娣òǎ骸、俚臀卤浔4娣?-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加?;ぜ?。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的?! 、诟杀4娣?-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存?! 、垡旱4娣?-196℃):是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下,  a、装安瓶管:使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中,将0.2~1ml的这种溶液分装于安瓶中,或在装有分散剂的安瓶中直接接种,或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中?! 、熔封安瓶管:若直接贮存于气相液氮中(-150℃~-170℃)时,则不需熔封?! 、检查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2~30分钟后,观察有无色素进入安瓶?! 、缓慢冷却:将熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱内缓慢冷却30~60min?! 、速冷:最后浸入液氮中快速冷却至-196℃?!?/font>

                                                    7、冷冻干燥保存法:其原理是首先将微生物冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上,从菌体中除去大部分水分后,细胞的生理活动就会停止,因此

                                                    可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存。在进行冷冻干燥时,需注意以下几个问题: 

                                                     a、冷冻干燥前的培养条件:首先检验菌种纯度。一般地说,将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若

                                                    为有芽孢或孢子的微生物,则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好,如细菌应达到109~1010/ml?! 、菌株号码等的标记:可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签?! 、安瓶的准备:将安瓶在2%HCl中浸泡过夜,自来水冲洗3次后,蒸馏水刷净,干燥,塞棉塞,贴标签,干热灭菌或温热灭菌后,60℃恒温干燥?! 、添加?;ぜ粒撼S玫谋;ぜ劣型阎?、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等?! ?/font>

                                                    8、甘油管保藏法:在5ml菌种保藏管中,将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后,于-20℃冰箱中保存。

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